נושא הפרוייקט

מספר פרוייקט מחלקה שמות סטודנטים אימייל שמות מנחים

בניית מערכת מודל של תא תחת תנאים תחומים

Reconstitution Of Cell-Like Compartments Under Confined Conditions

תקציר בעיברית

תנועה תאית זה תהליך המתרחש בתופעות ביולוגיות שונות, כמו ריפוי פציעות והחלמת רקמות, תגובת מערכת החיסון, גרורות של תאי סרטן והתפתחות עוברית. לכן, ישנה חשיבות בהבנת המנגנונים לתנועה תאית. בעקבות אינטראקציה עם הסביבה החיצונית, תאים יוצרים כוחות על ידי שינוי מבנים תוך תאיים של הציטוסקלטון במנגנון מבוקר. הציטוסקלטון הוא ג'ל אקטיבי של חלבונים פילמנטיים הקשור בקשרים פיזיקליים לממברנת התא. אחד ממבני הציטוסקלטון הוא קורטקס התא, שחקן משמעותי השולט על התכונות המכניות של התא העשוי מפילמנטי אקטין, מנועי מיוזין וחלבונים נוספים שונים. 
מחקר תנועה תאית יכול להיעשות in 'vivo' או in 'vitro'. במחקרים in 'vivo' האתגר העיקרי הוא שמתרחשים תהליכים רבים בו זמנית המשפיעים זה על זה ולכן זה כמעט בלתי אפשרי לזהות את הפרמטר שגורם לתופעה מסוימת. על כן עולה החשיבות לייצר מערכות מודל שיפחיתו את הסיבוכיות של מערכות תאיות ויאפשרו להבין את העקרונות הפיזיקליים של תהליכים תאיים. 
המטרה של מחקר זה היא ליצור דמוי-תא המכיל את החלבונים החיוניים להיבנות הקורטקס על מנת לבחון תנועה תאית תחת תנאים תחומים בהם שטח המגע של התא עם סביבתו גדול. כדמויי תאים נבחרו GUVs. GUVs מורכבות ממולקולות אמפיפיליות שיוצרות שכבה המפרידה בין התמיסה המימית הפנימית לבין החיצונית. במחקר זה GUVs מיוצרות בעזרת מערכת ה-cDICE. העיקרון המרכזי של השיטה מתבסס על הוספה של מונו שכבת ליפידים לטיפיות מים בשמן עם מונו שכבת ליפידים סביבן, בכך ליצור דו שכבת ליפידים- וזיקולות. 
במחקר זה מוצגות שיטות שונות למיון הוזיקולות הגדולות המיוצרות בשיטת ה-cDICE. הראשונה היא להפחית את הנפח של תרחיף הליפידים בשמן שבו הטיפיות נעות. השיטה השנייה היא להעלות את מהירות הסיבוב של תא ה-cDICE. בדרך זו, זמן התנועה של הטיפיות בפאזת השמן פוחת ולכן ההסתברות שטיפיות גדולות יהפכו לוזיקולות עולה. השיטה האחרונה היא ביצוע צנטריפוגה ואסיפה של וזיקולות מתחתית האפנדורף. 
לאחר הבנת הפרמטרים המשפיעים על גודל אוכלוסיית הוזיקולות, יוצרו וזיקולות עם הרכב דומה לזה של תאים חיים (DOPE,DOPS, LIVER PI, Cholesterol). בוזיקולות אלה התרחשה הפרדת פאזות מסיבה שעדיין אינה ידועה. התופעה תחקר בהמשך. 
לבסוף, בניסיון ליצור וזיקולות עם אקטין בתוכן, היה ניתן להבחין באקטין רק בקרבה לממברנה ולא באינקפסולציה כמצופה. סיבה אפשרית לכך יכולה להיות אוסמוזה מהוזיקולות אל הסביבה החיצונית בעקבות הפרש אוסמולריות שגורם לאקטין להיצמד אל הממברנה.  ניסוי המשך יבחן את התופעה תוך הקטנת הפרש האוסמולריות בין הסביבה החיצונית לפנימית.

תקציר באנגלית

Cellular motility is a process that occurs in many biological phenomena, such as wound and damaged tissue healing, immune responses, cancer cell metastases, and embryonic development. Therefore, it is essential to understand the mechanisms that cause cell motility. Through interaction with the environment, cells create forces by changing their cytoskeleton substructures in a controlled mechanism. The cytoskeleton is an active gel of filamentous proteins that physically link to the cell membrane. One of the cytoskeleton substructures is the cell cortex which is a central player in controlling the mechanical properties of the cell, and it is made of actin filaments, myosin motors, and other associated proteins.

Cell motility research can be done in vivo or in vitro. In in vivo studies, the main challenge is that cells carry out many processes that affect each other simultaneously. Thus, identifying the parameter that caused a specific phenomenon is almost impossible. Therefore, it is necessary to create reconstructed model systems that will reduce the complexity of cellular systems and allow an understanding of the physical principles of cell processes.

This study aims to create cell-like compartments containing the essential proteins for cortex reconstruction to examine cellular motility under confined conditions in which the cell has a large contact area with its environment. As cell-like compartments, Giant Unilamellar Vesicles were chosen (GUVs). GUVs are made from amphiphilic molecules that form a layer as an efficient boundary between an inner and an outer aqueous solution. GUVs were produced using the cDICE (continuous droplet interface crossing encapsulation) method. The main principle of this method is based on adding a lipid monolayer to water in oil droplets with an existing lipid monolayer; this way creates a lipid bilayer- vesicle.  
 
This study presents different methods for sorting large vesicles using the cDICE method. The first is to reduce the volume of the lipids in the oil dispersion in which the droplets move. The second is to increase the rotation speed of the cDICE chamber. This way, the movement time of the droplets in the oil phase is reduced. Thus, the probability of large droplets becoming vesicles increases. The last method is to perform centrifugation and collect vesicles from the bottom of the centrifuged eppendorf. 
 
After understanding the parameters that affect the vesicles size population, vesicles with a composition similar to a mammalian cell membrane (DOPE, DOPS, LIVER PI, Cholesterol) were prepared. Phase separation takes place in these vesicles for a yet unknown reason. The phenomenon will be investigated later.
 
Finally, in an attempt to encapsulate labeled actin inside the vesicles, actin could only be observed near the membrane, and encapsulation was not performed as expected. A possible reason could be the osmosis from the vesicles to the outer solution due to the osmolarity difference, which causes actin to approach the membrane. A follow-up experiment will test the phenomenon while reducing the osmolarity difference between the outer and the inner aqueous solutions.